มหาวิทยาลัยมหิดล ได้รับพระมหากรุณาธิคุณ จากพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัว ทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้สมเด็จพระบรมโอรสาธิราชฯ สยามมกุฎราชกุมาร เสด็จแทนพระองค์ ทรงวางศิลาฤกษ์มหาวิทยาลัยมหิดล กาญจนบุรี เมื่อวันเสาร์ที่ 18 เมษายน พ.ศ. 2541
มหาวิทยาลัยมหิดล วิทยาเขตกาญจนบุรี ประกอบด้วยส่วนงานต่างๆ ได้แก่ คณะเวชศาสตร์เขตร้อน คณะสัตวแพทย์ สถาบันวิจัยประชากรและสังคม และสำนักงานมหาวิทยาลัยมหิดล วิท
ยาเขตกาญจนบุรี โดยมีการบริหารหลักสูตรในระดับปริญญาตรีจำนวน 3 หลักสูตร 7 สาขาวิชา ดำเนินการโดยวิทยาลัยการจัดการ และคณะวิทยาศาสตร์
ในปีการศึกษา 2544 มหาวิทยาลัยมหิดล วิทยาเขตกาญจนบุรี เปิดรับนักศึกษาระดับปริญญาตรีรุ่นแรกในหลักสูตรของวิทยาลัยการจัดการ 2 หลักสูตร ได้แก่ หลักสูตรการจัดการบัณฑิต และหลักสูตรการบัญชีบัณฑิต แต่ยังคงจัดการเรียนการสอนในชั้นปีที่ 1 ณ ศาลายา
ต่อมาในปีการศึกษา 2545 ได้เปิดรับนักศึกษาในหลักสูตรวิทยาศาสตรบัณฑิต 3 สาขาวิชา ได้แก่ สาขาวิชาเทคโนโลยีการอาหาร สาขาวิชาวิทยาศาสตร์การเกษตรสาขาวิชาชีววิทยาเชิงอนุรักษ์โดยเริ่มจัดการเรียนการสอน ณ วิทยาเขตกาญจนบุรี พร้อมกันนั้นนักศึกษาวิทยาลัยการจัดการได้มาเรียนที่วิทยาเขตนี้พร้อมกันด้วย
ในปีการศึกษา 2547 หลักสูตรวิทยาศาสตรบัณฑิตได้เปิดรับนักศึกษาในสาขาวิชาธรณีศาสตร์เพิ่มอีก 1 สาขาวิชา ซึ่งนับเป็นการเปิดการดำเนินงานของวิทยาเขตในการจัดการเรียนการสอนอย่างเต็มรูปแบบตั้งแต่นั้นมา
ปีการศึกษา 2548-2549 การบริหารวิทยาเขตที่ยังขาดบุคลากรประจำโดยเฉพาะอาจารย์ประจำหลักสูตรทั้งหลักสูตรวิทยาศาสตรบัณฑิตและหลักสูตรการจัดการบัณฑิต ทำให้คณะวิทยาศาสตร์กำหนดให้นักศึกษาวิทยาเขตกาญจนบุรีชั้นปีที่ 1 ของปีการศึกษา 2548 เริ่มเรียน ณ ศูนย์ศาลายา เช่นเดียวกับนักศึกษาคณะต่างๆ ของมหาวิทยาลัยมหิดล เพื่อลดภาระงานสอนของอาจารย์ ณ วิทยาเขตกาญจนบุรีที่ต้องสอนในรายวิชาพื้นฐาน ให้มีเวลาเตรียมการเรียนการสอนในรายวิชาเฉพาะ และวิชาชีพมากขึ้น และทำให้นักศึกษาของวิทยาเขตมีความสัมพันธ์กับเพื่อนต่างคณะขณะเรียนที่ศาลายาด้วย
อย่างไรก็ดีในปีการศึกษา 2550 - ปัจจุบัน คณะวิทยาศาสตร์ วิทยาลัยการจัดการ และวิทยาเขตกาญจนบุรีได้มีการปรับเปลี่ยนผู้รับผิดชอบหลักสูตรเพื่อให้มีความเหมาะสมกับรูปแบบการบริหารจัดการการเรียนการสอน และสอดคล้องกับการประกันคุณภาพการศึกษามากยิ่งขึ้น โดยหลักสูตรวิทยาศาสตรบัณฑิตและหลักสูตรการจัดการบัณฑิตได้มีการปรับปรุงหลักสูตร และผู้รับผิดชอบใหม่ในปี 2552
จากผลการเสวนา “สานพลังมหิดล-คนเมืองกาญจน์ร่วมพัฒนามหาวิทยาลัยมหิดล กาญจนบุรี เพื่อภูมิพลังแผ่นดิน” ได้มีข้อคิดเห็นเสนอแนะจากชาวจังหวัดกาญจนบุรีและทีมบริหารมหาวิทยาลัยโดยมีวัตถุประสงค์เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการดำเนินงานวิทยาเขตกาญจนบุรี และเป้าหมายเพื่อเป็นมหาวิทยาลัยของจังหวัดกาญจนบุรี ได้มีการปรับโครงสร้างจากโครงการจัดตั้งมหาวิทยาลัยมหิดล กาญจนบุรี เป็นมหาวิทยาลัยมหิดล วิทยาเขตกาญจนบุรี เมื่อวันที่ 20 พ.ค. 2552
ในปีงบประมาณ 2553 มีการปรับโครงสร้างการบริหารงานและดำเนินการปรับปรุงแผนยุทธศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล วิทยาเขตกาญจนบุรี พ.ศ. 2552 – 2555
